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Chez les eucaryotes, le cycle cellulaire est constitué de deux parties : l’interphase et la mitose (ou phase M).
L’interphase est elle-même subdivisée en trois phases : G1, S et G2.
Au cours de la phase S a lieu la réplication de l’ADN, tandis que la mitose correspond au processus de division nucléaire conduisant à la division cellulaire.
Les phases G1 et G2 sont essentiellement des phases de croissance.
Le cycle cellulaire est régulé essentiellement par des protéines kinases dites dépendantes des cyclines, qui résultent de l’association d’une sous-unité catalytique Cdk ("Cyclin dependent kinase") avec une sous-unité activatrice cycline. Les travaux préparatoires à l’observation de ces complexes relèvent de la biologie moléculaire.
Il s’agit d’obtenir des plasmides comportant les ADNc (ADN complémentaires) des protéines d’intérêt qu’on souhaite observer.
Pour ce faire, la biologie cellulaire permet la production par les cellules de ces protéines étiquetées avec des fluorophores, dont les interactions sont étudiées par FRET ("Fluorescence Resonance Energy Transfer"), observé par FLIM ("Fluorescence Lifetime Image Microscopy").
En biologie moléculaire, Il faut obtenir l’ADNc codant pour une protéine d’intérêt, l’ubiquitine, partenaire de la cycline A, en fusion avec un fluorophore, mCherry, et le sous-cloner dans un plasmide (pGEX-4T1 par exemple).
On vérifie enfin sa séquence, c’est-à-dire sa succession des nucléotides A (Adénine), T (Thymine), C (Cytosine) et G (Guanine).
En biologie cellulaire, l’ensemble des manipulations sur les cellules cibles (culture, transfection, fixation sur lamelles de verre) conduit à l’observation des interactions entre les protéines d’intérêt. On vérifie en outre la morphologie des cellules et le taux d’expression des protéines fluorescentes.
La méthodologie se divise en trois étapes :
1) Sous-clonage de l’ADNc par PCR ("Polymerase Chain Reaction") et purification.
L’adjonction d’oligonucléotides au brin d’ADN comportant la séquence d’intérêt lui permet d’être amplifié spécifiquement par l’ADN polymérase.Les produits de PCR obtenus, une fois purifiés, doivent être vérifiés : leur taille (en nombre de double bases) est révélée après électrophorèse.
2) Obtention du plasmide (digestion, ligation)
Le produit de PCR et le plasmide receveur sont ensuite digérés par les enzymes de restriction Bam HI (G’GATCC) et Not I (GC’GGCCGC), et purifiés.On procède ensuite à la ligation de l’insert (produit de PCR) et du plasmide receveur, à l’aide d’une autre enzyme, la ligase. La ligation est orientée grâce à la complémentarité des séquences au niveau des sites de restriction.
3) Sélection, séquençage.
On transforme enfin des bactéries compétentes avec le produit de ligation. Elles sont cultivées sur des boîtes de LB agar en présence d’un antibiotique, l’ampicilline, pendant 18h à 37°C.
Notons que seules les bactéries transformées se développent, les plasmides contenant un gène de résistance à l’ampicilline.
Afin d’amplifier les plasmides, des clones sont ensuite isolés et mis en culture dans du milieu LB avec ampicilline pendant 18h à 37°, de nouveau.
On purifie alors les plasmides (kit NucleoSpin® Plasmid, Macherey-Nagel) : après lyse alcaline des bactéries, neutralisation et centrifugation, les plasmides sont liés à une membrane de silice.
Après lavage en présence d’éthanol, les plasmides sont élués dans des conditions de faible force ionique.
Enfin, de manière à sélectionner les clones de bactéries qui contiennent le plasmide avec l’insert, on fait digérer les plasmides par les deux enzymes Bam HI et Not I, et on effectue une nouvelle électrophorèse.
Les études sont conduites sur la lignée cancéreuse MCF-7 (cellules d’adénocarcinome du sein). En effet, ce type de lignées est aisé à cultiver, la multiplication des cellules cancéreuses n’étant pas freinée par l’inhibition de contact propre aux cellules saines. L’intégration des plasmides codant pour les protéines d’intérêt dans les cellules cibles est effectuée par transfection. L'agent de transfection utilisé est le DOTAP (DiOleoyl TrimethylAmmonium Propane, laboratoire Roche). De nature lipidique, il permet la formation de liposomes autour des plasmides, qui fusionnent pour la plupart avec la membrane plasmique des cellules.
Le FRET est un processus non radiatif par lequel de l’énergie d’un fluorophore "donneur" à l’état excité est transmis à un fluorophore "accepteur" [respectivement EGFP ("Enhanced Green Fluorescent Protein") et mCherry (protéine fluorescente rouge)] à proximité. On excite donc par laser pulsé le donneur qui, par couplage de dipôles, transmet de l’énergie à l’accepteur. À son tour excité, celui-ci retourne à l’état fondamental en émettant un photon que reçoit un capteur PMT ("Photo Multiplier Tube"); ce capteur renvoie le signal au système FLIM qui, connaissant le deltat entre ce signal renvoyé et l’émission d’un nouveau pulse, en déduira le temps de réponse par un comptage TCSPC ("Time Correlated Single Photon Counting"). Précisons que pour que le FRET se produise entre deux molécules, il faut d’une part que le spectre d’émission du donneur recouvre le spectre d’absorption de l’accepteur, d’autre part que leur distance soit
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<10nm br="" de="" dipolaire="" enfin="" et="" favorable.="" l="" leur="" moment="" orientation="" qu="" soit="">Dans le cadre des études portées sur le cycle cellulaire, une connaissance fondamentale manque encore :
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